李霞　 王向東　 林松　 宋若遠
(四川大學建筑與環境學院，四川 成都，610065)

　　摘要：本文從活性污泥中篩選出了具有較高絮凝活性的混合菌MBFH，研究了各種條件對微生物產絮凝劑的影響。研究結果表明，混合菌MBFH產絮凝劑的最佳培養條件為：溫度30℃、初始pH值8.0、搖床轉速為120r／min、培養基含糖量為2％、相對接種量為15％，其對高嶺土懸濁液的絮凝率可達到88％。
　　關鍵詞：混合型絮凝劑產生菌　 正交試驗　 培養條件　 生長曲線　

Study on optimum culture conditions of mixed flocculant－producing stain
Liaxia　 　Wangxiangdong　 　Linsong　　 Songruoyuan

　　Abstract: The mixed strains of MBFH which produced flocculating material was screened from activated sludge. In this paper, culture conditions for production of microbial flocculant were studied. The optimum culture conditions were found to be mixed microbial MBFH ,30℃, initial pH 8.0 , agitation rate 120rpm,the concentration of glucose 2%, relatively inoculums 15%,and the maximal fractional flocculation was about 88% in that conditions.
　　Key words: mixed flocculant-producing stain, culture conditions, growth curve, orthogonal test

　　微生物絮凝劑是利用生物技術,通過生物發酵、抽提、精制而得到的一種具有生物分解性和安全性的新型、高效、無毒的廉價的水處理劑[1]，因此具有逐步取代傳統絮凝劑的趨勢，并且應用的前景十分廣泛。目前對其的研究已成為當今世界絮凝劑研究的主要課題，但是對微生物絮凝劑的研究依然存在較大的局限性，且人們重點研究的仍是單一菌種，由于微生物自身的特點使其菌體的生長受到很多因素的影響，致使其所產生的絮凝劑的絮凝效果同樣受到很多條件的制約，而且由于微生物的培養成本較高使其在工業上的應用同樣受到一定的限制。而混合菌種具有適應環境的能力強的優點，這樣既可以提高菌種的生存能力又可以降低對其培養所需的成本。因此人們將微生物絮凝劑的研究方向投向既有生物降解能力又有絮凝能力的混合菌種[2]。本文從活性污泥中篩選出了絮凝效果較單一菌種好的混合菌種，通過研究確定了此混合型微生物絮凝劑產生菌合成絮凝劑的最佳培養條件，為其可以實現工業化生產提供依據。

1 材料及方法

1.1 菌種來源及培養基
　　菌種來源：污水處理廠二沉池的活性污泥
　　篩選培養基：葡萄糖10g，K2HPO4 　5g，MgSO4·7H2O 0.2g，尿素0.5g，KH2PO4 　2g，，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，水1000ml，pH值 7.5。
　　發酵培養基：葡萄糖20g，硫酸銨2g，KCl 0.5g，K2HPO4 　0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水 1000ml, pH值 7.0。
1.2 菌種分離與篩選
　　將活性污泥經篩選培養基富集培養后采用平板菌落稀釋法[3] 得到單菌落，將其制成菌懸液后按10％的接種量接種于發酵培養基中，試驗條件：溫度30℃，搖床轉速150r/min,pH值為7，發酵培養時間24小時。測定其發酵液的絮凝率，將篩選出的具有一定絮凝活性的菌株兩兩混合按1：1的比例接種于發酵培養基中進行發酵培養，以發酵液的絮凝率作為混合菌株篩選指標。
1.3 絮凝率的測定方法
　　于200ml燒杯中加入高嶺土懸濁液（1g/l，靜置90min后的上清液 ）93ml，1%CaCl2溶液5ml，發酵液2ml,用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液將pH值調至7.0左右。將其放置于磁力攪拌器上攪拌,快速攪拌1min,慢速攪拌2min,靜置15min 后,吸收上清液于721型分光光度計550nm處測定其吸光度OD550,以高嶺土懸濁液代替發酵液作對照,以絮凝率表示絮凝活性。絮凝率的計算公式為：

　　絮凝率(%) =(A-B)/A ×100%

　　式中　　A——對照樣上清液550nm處的吸光度,
　　　　　　B——絮凝后上清液550nm處的吸光度。

1.4 生長曲線的測定
　　在500ml三角瓶內裝200ml發酵培養基，溫度30℃，初始pH為8，以120rpm搖床培養。定時取樣測定其發酵液的pH值、菌體生長量（以濁度表示）及絮凝率。
1.5 培養條件優化試驗
　　本實驗采用正交試驗方法，以絮凝率為控制指標，在30℃條件下考察初始pH、搖床轉速、培養基含糖量及接種量等條件對混合型微生物絮凝劑產生菌的影響。
　　其試驗安排選取L9（34）正交試驗表[4]，因素水平見表1。

1.6 溫度對混合型微生物絮凝劑產生菌的影響
　　在由正交試驗所確定的最優產絮凝劑的培養條件下，將混合菌型微生物絮凝劑接種于裝有100ml發酵液的250ml三角瓶中，分別在10℃、30℃、40℃下發酵培養，分別測定發酵培養12、24、36、48小時的絮凝活性。
1.7 混合型微生物絮凝劑產生菌的絮凝活性的分布
　　將發酵液以3000rpm離心30min，分別取上清液、菌體（用蒸餾水洗滌后懸浮與上清液等體積的蒸餾水中）和發酵液測定其絮凝率。以未離心的發酵液的絮凝率為100％。

2 結果與討論

2.1篩選結果
　　本實驗經反復多次篩選得到具有一定絮凝活性的微生物共19株，其中酵母3株，真菌3株和細菌13株，絮凝活性結果見表2。

　　將具有絮凝活性的13株細菌類絮凝劑產生菌進行兩兩混合培養，經過反復多次的篩選，篩選出了絮凝活性穩定且比單株菌活性高的混合型絮凝劑產生菌（絮凝效果見表3），并命名為MBFH。對該混合型絮凝劑產生菌進行形態觀察可知，其中一株菌（菌名為X9）的菌落呈半透明狀，周邊圓滑，表面光滑濕潤，粘性大。鏡檢時該菌呈桿狀, 無芽孢，為革蘭氏陽性菌，且在溫度為37℃條件下培養能夠快速生長。另一株菌（菌名為X21）的菌落表面較干燥、不光滑，粘性較小。鏡檢時該菌呈短桿狀, 無芽孢，為革蘭氏陽性菌，且在溫度為37℃條件下培養生長緩慢。

2.2 MBFH的生長曲線
　　為了解混合菌的生長周期及其與絮凝率變化的關系，對混合菌MBFH的生長曲線進行測定。菌體生長量（OD660）、pH值和絮凝率的關系如圖1所示。

　　由圖1可知，在發酵培養過程中，混合菌MBFH在3小時后進入對數生長期，在16小時后到達穩定期，此時絮凝率達到最大（87％），在此之后緩慢下降并趨于穩定。這說明混合菌MBFH具有穩定的產絮凝劑能力，并且發酵液的絮凝率隨菌體生長量的增加同步升高，這表明此混合型微生物絮凝劑的絮凝活性物質是由微生物在發酵過程中生物合成，而非微生物細胞自溶而產生，該結果與文獻報道[3]的微生物產絮凝劑的結果相一致。同時由圖1還可看出，發酵液初始pH隨著菌體的生長而迅速下降，并于發酵培養15小時后pH降至4.30，隨后趨于穩定。這是由于微生物對糖的吸收利用的過程中產酸，也可能是由于微生物絮凝劑本身是酸性的，隨著絮凝劑的不斷產生而使發酵液的pH值降低。
2.3 培養條件優化試驗結果
2.3.1 MBFH培養條件優化正交試驗結果分析
　　為了考察培養基的初始pH值、含糖量、搖床轉速以及接種量對該絮凝劑產生菌的影響，確定其產絮凝劑的最佳條件。根據正交試驗所設計的各種培養條件對MBFH混合菌進行培養（同時做兩組平行），試驗結果見表4。

　　從表4可以看出，培養基初始pH值變化對混合菌MBFH的絮凝活性的影響最大，混合菌MBFH在偏堿性環境條件下較適于絮凝物質產生。而培養基含糖量、搖床轉速和相對接種量對絮凝活性影響作用較小。各因素對微生物絮凝劑的絮凝效果的影響程度大小的順序為：培養基初始pH值>培養基含糖量>相對接種量>搖床轉速。由以上四個因子水平對指標均值mi做直觀分析見圖2。由圖可見，pH值為8、搖床轉速為120r/min、培養基含糖量為2％、接種量為15％的絮凝率最高。因而絮凝劑產生菌的最佳培養條件是A₃B₁C₂D₃。此條件與正交試驗中的產絮凝劑的最佳條件A3B2C1D3相比，搖床轉速低，這樣可降低絮凝劑合成的能源消耗。因此本試驗將A₃B₁C₂D₃方案確定為最佳培養條件。

2.3.2 溫度對MBFH產絮凝劑的影響
　　由正交條件所確定的最優產絮凝劑培養條件，分別在10℃、30℃、40℃下對混合菌MBFH進行發酵培養，測定其絮凝活性，其結果如圖3所示。
　　由圖3可見，溫度對微生物積累絮凝劑有明顯的影響?；旌暇鶰BFH在30℃下的絮凝活性最高，在發酵培養12小時之后，絮凝率基本上穩定在80％左右。該混合菌在10℃、40℃下的絮凝活性仍較穩定，在10℃下在發酵培養24小時，絮凝率達到最大值(60％)；在40℃下在發酵培養15小時左右，絮凝活性達到最大值，絮凝率為53.09％。 因此，溫度為30℃的發酵培養條件最適于混合菌MBFH產絮凝劑物質。發酵培養的溫度過高或過低都會影響該混合菌產絮凝劑的能力，溫度過高會使細胞組成成分蛋白質、核酸等發生變性，影響細胞的生長代謝，而溫度過低則使反應速度降低，酶活性下降，代謝產物積累時間延長，不利于絮凝劑的產生。

2.4 MBFH的絮凝活性分布
　　根據絮凝活性分布試驗結果（見圖4）來看，混合菌MBFH絮凝活性約94.8％存在于上清液中，說明起絮凝作用的物質存在于發酵液中，是由菌體在發酵過程中產生并分泌到細胞外而成的；而菌體懸液的絮凝率出現負值，這是由于菌體懸液具有一定濁度，同時說明菌體細胞無絮凝效果，也說明菌體的存在干擾對高嶺土懸液的絮凝效果?；旌暇鶰BFH的發酵液經過4℃、35℃、60℃、80℃、100℃處理30min后測定其絮凝活性。結果發現（見圖5），當熱處理高達100℃時，絮凝活性下降至10％。由于某些以蛋白質為主要成分的微生物絮凝劑的活性受溫度的影響較大，高溫時變性，喪失部分絮凝能力[5]，而由多聚糖構成的絮凝劑則基本不受溫度的影響[6]。因此推斷該微生物絮凝劑包含一部分熱不穩定物質，即蛋白質類物質和一部分熱穩定物質，為多聚糖類物質。或者是由于加熱造成線狀分子的無規卷曲導致橋聯作用的喪失，而電中和作用依然存在。

3 結論

　　（1）試驗結果表明：從活性污泥中分離篩選出了混合菌MBFH。該混合菌的產絮凝劑的最佳培養條件為：溫度 30℃、初始pH值8.0、搖床轉速為120r／min、培養基含糖量為2％、相對接種量為15％；在此條件下，最大絮凝率約為88％。
　?。?）混合菌MBFH培養時間為16小時，在此時間內菌體生長量達到最大，且絮凝活性達到87％，其所合成的絮凝物質主要是由菌體在發酵過程中產生并分泌到細胞外而成的。
　　同時需要指出的是，此混合型微生物絮凝劑產生菌的菌種鑒定及其菌種的混合比例有待進一步的深入研究。

參考文獻

1.鄭懷禮.生物絮凝劑及絮凝技術.化學工業出版社，2004，1.
2.肖琳等主編.環境微生物實驗技.中國環境科學出版社，2004，7.
3.Kurane R. Screening for characteristics of microbial flocculants[J] Agric Biol Chem,1986,50(9):2301-2307.
4.陸璇編著.數理統計基礎.清華大學出版社，1998.
5.Ryuichiro Kurane. Culture condition for production of microbial flocculant by Rhodococcus erythropolis[J] Agric Biol Chem, 1986,50(9):2309-2313.
6.Hiroaki Takagi. Purfication and chemical properties of a flocculant produced by Paocilomyces Sp.[J] Agric Biol Chem, 1985,49(11):3159-3164.

作者簡介：李霞，女，1979?，F就讀四川大學環境工程研究生，主要從事水污染控制方向。