從啤酒發酵廢水中提取核糖核酸
許寧，李志富，馮文華
（泰山醫學院工程學院，山東 泰安 271000） 摘要：廢酵母是啤酒工業廢水中的主要污染物。在常溫下，用10％的淡鹽水，從廢酵母中提取核糖核酸和脫核酵母，回收率為3.3％～3.5％和65.2％～66.5％。對提取液進行預處理后，核糖核酸產品純度大于90％。提取核糖核酸和脫核酵母后廢水的BOD5 和CODcr分別下降81％和78％以上。
關鍵詞：啤酒；發酵；廢水；核糖核酸；脫核酵母
中圖分類號：X791 文獻標識碼：A 文章編號：1009－2455（2003） 03－0047—03 Extradion of Ribonucleic Acid fFOm Fermentation Wastewater of Brewery
XU Ning，LI Zhi-fu，FENG Wen－hua
（School of Engineering Taishan Medical College，Taian 271000,China） Abstract:Spent yeast is the main pollutant in the wastewater from breweries. The recovery rates of ribonu-cleic acid and deribonucleic yeast from spent yeast ambient temperature using 10％ dilute brine are 3.3％～3.5％and 65.2％～66.5％respectively.After the pretreatment of the extract，the purity of the ribonucleic acid proauct exceeus 90%.Alter the extraction of ribonucleic acid and deribonucleic yeast，the BOD5，and CODcr of the wastewater decrease by 81％and 78％ respectively.
Key words：beer；fermentation; wastewater; ribonucleic acid; deribonucleic yeast 目前，我國年產量在 10×l04 t以上的啤酒廠有幾十家，最小的年產量也在 10×103 t左右。這些廠遍布全國各地，生產中排出大量含有碳水化合物、蛋白質等物質的廢水。據統計，每生產11啤酒約產出12—15 m3 的廢水，當前全國啤酒年產量約為 2 ×l07t，每年產生大約 3×l08 m3 的廢水。啤酒工業廢水的污染指標因所在地區和生產工藝的不同而略有差異，但大部分ρ（CODcr）＞1500 mg/L，ρ（BOD5）＞1000 mg/L，ρ（SS）＞280 mg/L[1]。
啤酒廢水中有機物主要來自釀造工序，如發酵過程中含有酵母殘余物、廢酵母的廢水，其BOD5 的質量濃度高達 6800－13000 mg／L，約占整個廢水BOD5的82％[2]，而其中的廢酵母是主要污染物，1 g干酵母產生的 BOD5 約為 0.4 g[3]。因此，將這部分廢水中的廢酵母加以利用，提取核糖核酸并生產飼用脫核酵母，可變廢為寶，同時，大大降低廢水處理負荷。我們利用啤酒廠釀造工序廢水中的酵母，通過鹽析方法提取試驗，回收高純度、低濁度的核糖核酸，確定了可行的工藝條件。 l 原理 酵母中核糖核酸（RNA）的質量分數為 2.67％－10.0％，脫氧核糖核酸（DNA）的質量分數為0.03％－0.516％，其他真菌中RNA的質量分數為0.665％－28.5％，DNA的質量分數為0.15％－3.30％[4-5]。啤酒酵母中的核糖核酸大多與蛋白質結合成核蛋白，被包含在酵母細胞內，菌體外有一層堅韌的細胞壁。鹽析法提取酵母中的核糖核酸是通過改變細胞的滲透壓，利用其溶于水的特性使其溶解于水中，再通過調節pH值，將核糖核酸從溶液中沉淀出來，經分離、洗滌、干燥后得成品核糖核酸。
試驗流程如圖1所示。 2 試驗原料和方法 2.1 原料
啤酒廢酵母：來自啤酒廠釀造車間；食鹽（市售）；鹽酸、氯化鈣、氫氧化鈉（工業級）、無水乙醇（分析純）；絮凝劑（工業用）。 
2.2 設備、儀器
帶攪拌和換熱裝置的敞口反應器，板框壓濾機、離心分離機、沉淀漕、真空干燥器、751 GW型分光光度計、PHS－gV酸度計。
2.3 分析方法
至今，市場上對核糖核酸產品質量還沒有一個統一的標準，只是國際上一些公司常用的技術標準。一般包括RNA含量（純度）、濁度、pH值等。RNA含量采用鋁藍比色法。水分采用重量法測定。濁度的分析方法通過透光率測定。
2.4 試驗方法
整個實驗采用正交試驗法，以確定最佳工藝條件。每組試驗基本步驟為：
①將當日排放的廢酵母，用清水洗滌3～4次，沉淀 30～40 h后，除去上層清水，取樣測定沉淀的水分。
②將水洗后含酵母20％－25％的原液加人反應器，按不同的濃度加人精制食鹽，攪拌均勻后調節pH值，然后迅速升溫至90℃，并在90～95℃下保溫2～3 h。
③將鹽析完成的物料冷卻至50～55℃，加入適量絮凝劑，然后進行重相、輕相離心分離、洗滌。重相用于生產飼用脫核酵母。
④在分離出的清液中加人助凝劑和絮凝劑，控制適當的 pH值，沉淀后 2 h后進行分離。
⑤上步分離的清液冷卻至 20℃以下，用 6mol／L的鹽酸迅速把pH值調至2.0左右，并加入少量氯化鈣，沉淀0.5 h后，去掉上清液，再離心分離。
⑥用pH為2.0左右的去離子水洗滌濾餅數次，除去殘鹽及水溶性雜質。
⑦用不同濃度的乙醇分別洗滌濾餅數次，以便除去醇溶性雜質和色素。
⑧過濾除去乙醇，并在55～60℃的真空干燥器中干燥，然后粉碎過80目篩得成品核糖核酸。 3 試驗結果與討論 3.1 核糖核酸的回收率
濕酵母含水75％～80％，每批試驗投料為折干酵母 500 g。回收率數據如表 1。以干酵母為基準的回收率，核糖核酸的質量分數為3.3％～3.5％，脫核酵母的質量分數為65.2％～66.5％。
表1 回收率試驗數據 |
| 序號 | 核糖核酸 | 脫核酵母 |
|
| 干重/g | 質量分數／％ | 回收率／％ | 干重/g | 回收率／％ |
| 1 | 18.6 | 91.2 | 3.4 | 331.0 | 66.2 | 2 | 18.1 | 91.2 | 3.3 | 332.5 | 66.5 | 3 | 18.2 | 90.9 | 3.3 | 331.5 | 66.3 | 4 | 18.7 | 91.0 | 3.4 | 327.0 | 65.4 | 5 | 19.3 | 90.7 | 3.5 | 326.0 | 65.2 | 6 | 18.2 | 90.5 | 3.3 | 327.5 | 65.5 | 7 | 19.4 | 90.2 | 3.5 | 329.5 | 65.9 | 8 | 19.4 | 90.1 | 3.5 | 328.5 | 65.7 | 平均 | | 90.7 | 3.4 | 328.5 | 65.8 |
|
3.2 鹽析的影響因素
影響鹽析中核糖核酸回收率的主要因素有鹽質量分數、溶液出值和升溫速率。其中在溶液pH值6.0～7.0 時，鹽質量分數影響結果如表 2 所示。
鹽的質量分數在 9.0 ％～11.0 ％時，回收率可達3.4％以上；鹽的質量分數在 7.0％～9.0 ％時，回收率為 3.0 ％～3.3％；當鹽的質量分數低于 7.0％后，回收率大幅度下降。試驗還表明，加鹽后必須快速將溶液升溫至90℃，盡可能縮短20～70℃之間的停留時間，減少磷酸二脂酶的降解率，提高核糖核酸的回收率。 表2 鹽的質且分貝對核出核糖核酸回收率的影響 |
| 序號 | 溶液鹽的質
量分數／％ | 核糖核酸 | 純核糖核酸
回收率／％ |
|
| 干重/g | 質量分數／% | |
| 1 | 11.0 | 19.3 | 90.8 | 3.5 | 2 | 10.0 | 19.3 | 90.7 | 3.5 | 3 | 9.0 | 19.2 | 91.1 | 3.4 | 4 | 8.0 | 18.2 | 90.9 | 3.3 | 5 | 7.0 | 16.4 | 91.2 | 3.0 | 6 | 6.0 | 14.8 | 91.0 | 2.7 |
| | （pH=6.0～7.0.每批投料 500 g 折干酵母） |
3.3 抽取液的預處理
為獲得低濁度的核糖核酸，對分離出的抽取液進行預處理是關鍵的一步。在鹽析后、分離前加人適當的絮凝劑有利于輕、重相的離心分離，但投加量過多會影響洗滌效果，造成較大流失，影響回收率。經過篩選試驗，采用聚丙烯酸鈉做絮凝劑，用氯化亞鐵作助凝劑，在 pH=6.0±0.5時，效果較好。沉降后的清液直接分離核糖核酸，產品的濁度仍然高于 26％，必須將其中懸浮的顆料進一步分離。試驗中采用硅藻土過濾機進行過濾，使產品的濁度控制在17％～20％之間。
預處理主要除去的是微粒狀懸浮物和部分自港蛋白質，要將大部分自溶蛋白質除去，還要進一步研究適當的工藝條件。
3.4 核糖核酸的分離
在常溫條件下，將預處理后的抽取液，控制pH值為2.0左右即可沉淀出核糖核酸。與常用的低溫法相比，回收率沒有下降。加人0.5%～1.0％的氯化鈣后，使沉淀時間由原來的 2h 以上縮短到0.5 h 以內，且沉淀效果明顯好轉，離心分離容易。
核糖核酸在稀堿或酸性條件下，都會產生不同程度的降解，只在低溫酸性條件下比較穩定。所以，加入少量氯化鈣促進沉淀，不但可以縮短常溫下停留時間，而且可以減少降解損失。
3.5 對廢水污染的控制效果
來自釀造工序的廢水通過沉降、過濾分離后，所含廢酵母的81％～84％被分離下來，試驗所用幾次廢水水樣分離前后的BOD5，CODcr，SS數據列于表3。分離酵母后，廢水的BOD5，和CODcr分別下降80％和78％以上。 4 回收量分析 不同廠家釀造工序的廢水量波動較大，一般含廢酵母17～33 g／L，經沉降、過濾可分離出其中的81％以上。當核糖核酸回收率達到3.3％時，可從每升廢水中回收0.6～1.1g 的核糖核酸，同時回收11.1～21.5 g 的脫核酵母。每公斤干酵母消耗食鹽為 1 kg。洗滌用乙醇循環使用，但損耗較大，約為30％。 表3 分離酵母前后水樣的分析結果 |
| 序號 | 分離前 | 分離后 |
|
| ρ（BOD5）／
（mg·L-1） | ρ（COD）／
（mg·L-1） | ρ（SS）／
（mg·L-1） |
ρ（BOD5）／
（mg·L-1）
| ρ（COD）／
（mg·L-1） | ρ（SS）／
（mg·L-1） |
| 1 | 10137 | 712 | 10180 | 1923 | 143 | 772 | 2 | 10950 | 691 | 11072 | 2061 | 137 | 593 | 3 | 12420 | 387 | 12561 | 2294 | 132 | 654 | 4 | 13017 | 578 | 13095 | 2407 | 110 | 815 | 5 | 12366 | 614 | 12505 | 2299 | 117 | 930 |
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5 結論 ①本工藝在常溫下用淡鹽提取核糖核酸，與常規的低溫濃鹽法相比，在保證較高回收率的前提下，縮短了生產周期，降低能耗。
②回收的核糖核酸產品純度大于90％，濁度小于20％。
③用該方法提取核糖核酸，并同時回收脫核酵母后，釀造工序廢水的BOD5 和CODcr 均有較大幅度的降低。 參考文獻： [1] 管敦義.啤酒工業手冊[M].北京：輕工業出版社，1998
[2] 大連輕工業學院，無錫輕工業學院.釀造酒工藝[M].北京：輕工業出版社，1992.
[3] 張永明，俞俊棠，王建龍.處理啤酒洗槽廢水同時生產單細胞蛋白[J].環境科學，2000，21（3）：97－99.
[4] 中國科學院微生物研究所.微生物在工業上的應用[M].北京：科學出版社，1971.
[5] Rehm H J.Industrielle Mikrobiogie[M].New York：Springer－Verlag Berlin，Heidelberg，1967.
作者簡介：許寧（1961－），男，江蘇南京人，高級工程師，從事水污染控制工程的研究與教學工作，電話（0538）8513255。 | 
