王 軍 劉寶章 任久長
北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)中心 10087

課題背景

　　農(nóng)藥廢水的治理是目前環(huán)保工作的難點(diǎn)之一。新型化學(xué)農(nóng)藥一擬除蟲菊酯類、雜環(huán)類農(nóng)藥，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成步驟多，中間體繁雜，致使這兩類農(nóng)藥廢水成分極其復(fù)雜，含有大量有毒或難降解的有機(jī)化合物，以及CN-、Cl-、SO42-等無機(jī)鹽，對生物體毒害極大。在國外一般采用代價昂貴的、而且易造成二次污染的焚燒方法。在我國，這類農(nóng)藥的廠家大多建有生化處理裝置，但目前幾乎沒有一家能夠獲得理想的處理效果。擬除蟲菊酯類、雜環(huán)類農(nóng)藥低毒（對人畜）、高效、低殘留量、環(huán)境相容性好，將逐漸取代有機(jī)磷農(nóng)藥。考慮到實際需要與將來應(yīng)用前景，我們進(jìn)行該類農(nóng)藥及其廢水的微生物降解研究，并在南京第一農(nóng)藥廠進(jìn)行現(xiàn)場試驗。

研究方法

1、材料
　　土壤樣采自南京第一農(nóng)藥廠廢水處理車間排水口附近的砂土，剔除雜草雜物。
　　營養(yǎng)培養(yǎng)基：蛋白陳10g，牛肉膏5g，NaCl5g, 1000mLH2O中。pH值7.2。選擇性培養(yǎng)基ＶＫ的無機(jī)鹽溶液：K₂HPO₄ 0.1g,MgSO₄.7H₂O 0.2g,(NH₄)₂SO₄ 0.1g,CaSO₄0.04g,FeSO₄.7H₂O 0.01g,1000MlH₂O中。pH值7.2-7.4.綜合有機(jī)廢水取自南京第一農(nóng)藥廠集水池，有關(guān)性質(zhì)見表1。

表1 有機(jī)廢水的有關(guān)性質(zhì) COD(mg/L) BOD(mg/L) pH 鹽度（%） CN-（mg/L) 1.0-2.0×10⁴ 2000-3000 10-12 4.0-6.0 30-40

　　吡蟲啉、噠螨靈、溴氰菊酯、甲氰菊酯、醚醛、咪唑烷等成品農(nóng)藥來自南京第一農(nóng)藥廠，商品級。苯、吡啶，市購，化學(xué)純級。
2、試驗步驟
　　降解菌的富集：取10g土樣加到1000mLＬ富集培養(yǎng)基中，調(diào)整pH值7.2左右，置于恒溫振蕩器上，30℃，120rmp連續(xù)震蕩培養(yǎng)48小時。移取10mL活性培養(yǎng)液于100mL選擇培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器上，30℃，120rmp連續(xù)振蕩培養(yǎng)48小時。從上述活性菌液中挑取、一環(huán)在VK固體培養(yǎng)基上劃線，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天直至平板上出現(xiàn)明顯可見的菌落。
　　液體轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：從平板上挑取單個菌落移入含10mL選擇培養(yǎng)基（廢水作為能源、碳源）的25mL小試管中，置于恒溫振蕩器上，30℃，120rmp連續(xù)震蕩培養(yǎng)24小時。
　　廢水降解試驗：以10% 的接種量，將上述單株苗的24小時活性培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移交原底水與VK無機(jī)鹽溶液不同配比的培養(yǎng)基中（250錐形瓶），置于恒溫振蕩器上，30℃，120rmp連續(xù)底物利用試驗：在100mLVK無機(jī)鹽溶液中分別添加：苯5mL,，吡啶0.5mL，醚醛2.0mL，二氯1.0mL，咪唑烷50mg，吡蟲啉100mg，噠螨靈100mg，制成瓊脂培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)48小時的活性菌液0.1mL于上述含有不同底物的平板上。
　　HgCl₂的抗性試驗：在以廢水作為能源的VK選擇培養(yǎng)基中分別加入一定量的HgCl₂,制成瓊脂培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)48小時的活性菌液0.1mL于上還含有不同濃度HgCl₂的平板質(zhì)粒檢測：質(zhì)粒提取、分離采用堿裂解法，用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒。

結(jié)果與討論

1、分離菌株的部分生理生化性狀
　　通過富集、分離、純化，最后篩選得到了3株能以有機(jī)廢水作為唯一能源的降解菌株,其部分生理生化性狀見表2。

表2 3株細(xì)菌的部分生理生化性狀 菌株 需氧性 運(yùn)動性 耐鹽性（NaCl%) 對HgCl2的抗性（mg/L培養(yǎng)基） 1.0 5.0 10.0 15.0 20.0 W1 兼性 + 5.0 + - - - - W2 兼性 + ＜2.5 + + + + + W3 好氧 　 7.5 + - - - -

　　菌株W1、W2呈現(xiàn)兼氧性，在有氧條件下生長活躍，但在厭氧或缺氧條件下仍然能夠存活，這種屬性對于我們進(jìn)一步的SBR工藝是有利的。現(xiàn)場的有機(jī)廢水鹽度相當(dāng)高（4-—6%），對微生物生長有一定的抑制作用，菌株的耐鹽性能也是十分重要的。W2菌株對HgCl2具有相當(dāng)高的耐受力。
2、單株菌的降解譜
　　通過底物利用試驗，考察了3株菌能夠降解的化合物種類，見表3。

表3 3株菌對底物利用試驗結(jié)果 菌株 苯 吡啶 咪啶烷 醚醛 溴氰 甲氰 吡蟲啉 噠螨靈 二氯 W1 + + + - - - - - - W2 + + + - + + + + - Y3 + + + + 　 　 + 　 -

　　3 株菌能降解的化合物種類是不同的。對于農(nóng)藥中間體的基本基團(tuán)，如苯、吡啶、咪唑烷等，3株菌都能降解。通過觀察菌落最先出現(xiàn)的時間、生長速度、大小，發(fā)現(xiàn)W₁、Y₃對廢水的利用情況較好，而ＷＺ能降解的化合物種類較多。

3、廢水降解試驗

3.1 單株菌降解能力
　　W1、W2、Y3對不同濃度廢水的降解結(jié)果見表4。

表4 單株菌降解廢水能力對比（一周） 菌株 起始COD=1600-1700mg/L 起始COD=3000-3500mg/L 終止COD（mg/L) COD去除率（%） 終止COD（mg/L) COD去除率（%） W1 895 46.1 2010 35.8 W2 1200 27.8 3060 14.8 Y3 1190 30.1 2360 28.5

　　可見，無論是在較低污染物濃度下（進(jìn)水COD濃度1600-1700mg/L),還是在較高COD濃度條件下（進(jìn)水COD濃度3000-3500mg/L），W1的降解效果均是最好的，Y₃次之，W₃對綜合廢水的降解能力較差，尤其是對高濃度的廢水降解效果很弱。
3.2 混合菌降解試驗
　　將3株菌的活性菌液按1:1:1的比例混合，接種到以廢水為能源的體系中培養(yǎng)一定時間，蕎得性質(zhì)穩(wěn)定的混合菌群。將這種混合菌培養(yǎng)至對數(shù)期，接種到不同濃度的廢水體系中，使初始菌濃度達(dá)到2.0×108cells/mL，其降解效果列于表5。

表5 混合菌降解廢水試驗 時間（天） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） 0 1880 　 3220 　 6980 　 9520 　 11400 　 1 947 49.6 2110 34.4 5400 22.6 9020 5.3 11300 0.9 3 692 63.2 1190 63.0 3650 47.7 6970 26.8 8230 27.5 5 581 69.1 1170 63.7 3060 56.2 5720 39.9 7970 30.1 7 488 74.0 943 70.7 2320 66.8 4980 47.7 7430 34.8

　　混合菌的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單株菌，其對有機(jī)污染物的耐受程度也大大提高，即使廢水COD濃度高達(dá)6980mg/L時，一周后的去除率也有66.8%。
3.3 細(xì)菌的“協(xié)同”效應(yīng)
　　混合菌的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單株菌。推測，這3株菌對廢水中的有機(jī)污染物的降解反應(yīng)是相互補(bǔ)充的。將每株菌己經(jīng)作用至降解平衡（7d）的廢水體系等體積混合，在恒溫振蕩器上繼續(xù)作用一定時間，考察其COD變化。
　　W1、W2、Y3菌液起始COD分別為1230、1580、1360mg/L，等體積混合后COD濃度為1330mg/L，其COD的變化情況見表6。

表6 單株菌“協(xié)同”降解效應(yīng) 作用時間（天） COD（mg/L) COD去除率（%） 0 1330 　 1 1220 8.3 3 1090 18.0 5 1070 19.5 7 960 27.8

　　不同菌液混合后，體系COD濃度繼續(xù)下降，可見單株之間是具有“協(xié)同”作用的。對作用7d后的茵液平板劃線，觀察結(jié)果表明，出現(xiàn)菌落最多的是W1菌株，可見W1菌株成為該生態(tài)體系中的優(yōu)勢菌種（predominant bacteria）人關(guān)于“協(xié)同”作用機(jī)理詳見別處。
3.4 降解性質(zhì)粒
　　分離菌株的堿裂解一瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖１。

　　結(jié)果表明，被檢測的菌株均含有質(zhì)粒，分子量大于1.5Kb。關(guān)于降解性質(zhì)粒的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)移性、活性正在進(jìn)一步的研究之中。
4、結(jié)論
　　（1）直接以有機(jī)農(nóng)藥廢水作為唯一能源和碳源，具有較大的選擇壓力，分離、篩選得到的降解菌對于廢水的降解有著較大的活性。
　　（2）單株菌的降解能力是十分有限的；由單株菌組成的混合菌的降解能力極大提高，單株菌對廢水中污染物的降解反應(yīng)是互補(bǔ)、具有”協(xié)同”效應(yīng)的。
　　（3）已經(jīng)證明，降解有機(jī)污染物的酶系大多數(shù)由質(zhì)粒基因編碼，因此，下一步的研究重點(diǎn)之一是3株菌的降解性質(zhì)粒，包括質(zhì)粒的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)移性及其在廢水體系中的轉(zhuǎn)移、表達(dá)等規(guī)律。