童中華 胡洪營 魏東斌
(清華大學環境科學與工程系 環境模擬與污染控制國家重點聯合實驗室 北京 100084)

　　在發光細菌的應用過程中人們發現并分離出了它的自發暗變種（K變種），如1980年Ulitzue等從鮒魚發光桿菌P. leiognathifenli分離到自發暗變種，并根據化合物使暗變種恢復發光的能力檢測其致突變性，證明在各種堿基置換劑和移碼劑存在下，可大大提高暗變種在世代中的回復突變率。文獻證明DNA合成抑制劑和DNA插入劑也可提高其回復突變率。該項技術已被美國Azur公司（原Microbics公司）定名為Mutatox^TM方法。
　　顧宗濂于1993年首次在國內報道利用自行分離到的明亮發光桿菌的自發暗變種T9171菌株，測試五種遺傳毒物的致突變性，指出暗變種對化合物致突變效應的靈敏度高于Ames試驗，發光細菌暗變種試驗可望成為一種簡易靈敏的生物致突變性測試方法。
　　本文對發光細菌暗變種的檢測原理、測試方法和應用研究作簡要介紹，并與Ames試驗進行比較，以推進暗變種方法在我國環境監測中的研究和應用。

1. 檢測原理
　　對發光細菌經過理化方法誘變處理后，使其失去發光能力或發光強度極弱，稱為暗變種（K. variant）。若暗變種接觸致突變物，在世代分裂時可導致突變，恢復一定程度的發光能力。利用暗變種恢復發光的現象，可對各種遺傳毒物或環境樣品進行篩選、檢測。這可能是由于致突變物使調節基因發生突變，使其不能產生或產生無活性的抑制物質，也可能使DNA雙鏈發生構象改變，使抑制物質不能與之結合而失去抑制效應，總之，真正的回復突變機理目前還不清楚。

2. 測試方法
　　AZUR 公司采用費氏弧菌Vibrio fischeri 的暗變種M 169，制成凍干粉于-20℃保存，測定前復蘇，在27-30℃與待測物接觸16，20，24小時或更長時間以后檢測發光強度，同時做陰性和陽性對照。一般規定，對某一化合物的所有測試濃度，若樣品發光比陰性對照發光≤2，則認為該化合物無致突變性；若樣品的發光為陰性對照的至少2倍，則認為反應陽性，至少連續2個濃度為陽性才能確定為有致突變性。
　　顧宗濂在研究初期采用暗變種的新鮮培養液，20℃環境中待測物與培養液在測定管中靜止培養，于0，14小時以后每隔4小時測發光強度，至各管發光強度達最大值后明顯下降為止。若樣品的最大發光值為同一時間空白對照的至少2倍，則認為反應陽性。1999年謝思琴、顧宗濂等報道了采用4℃保存的暗變種凍干粉，20℃振蕩復蘇，與待測化合物接觸振蕩培養24小時后每隔3-4小時測定一次發光強度。以樣品發光強度為空白對照的3倍者為陽性效應，若樣品的5個平行系列中有3個陽性效應，即認為該樣品具有致突變性；若樣品的平行系列中陽性效應數不足3個，則認為陽性可疑。

3. Mutatox與Ames試驗的方法比較
　　Mutatox與Ames試驗屬于體外致突變性檢測方法，都是細菌法，使用大鼠肝臟提取液S9作為代謝活化因子。Mutatox與Ames試驗相比具有快速、簡便等特點，具體從以下幾點加以討論：
　　(1) Mutatox試驗中使用的發光細菌暗變種是從AZUR 公司購買的真空包裝凍干粉，-20℃保存，測試菌株不需要進行預試驗，復蘇凍干粉即可用于試驗。Ames試驗中菌液準備工作量大。冷凍保存的菌種先進行增菌培養，然后進行菌株生物學性狀的鑒定，若生長及生物學性狀不符合要求，應對其進行劃線分離。此外還要進行例如各種培養基、營養液的準備和滅菌等準備工作。
　　(2) Mutatox試驗不需要嚴格的無菌條件。一般情況下Mutatox測試不受環境中存在的非發光細菌的影響，只有當雜菌的濃度過大（約大于105/mL）時才需要用0.22μm的膜進行過濾。同時，Mutatox測試介質含有高濃度鹽、低濃度營養液和一些廣譜性抗菌素，相對高濃度測試菌株的加入，以及測試終點的檢測特點，大大降低了可能進入測試系統的雜菌對測試結果的影響。Ames試驗需要進行嚴格的無菌操作，對工作人員的微生物實驗技能要求較高。因為雜菌的存在會嚴重影響平皿滲入法計算回變菌落數。
　　(3) Mutatox方法不需要繁瑣且昂貴的連續培養，批量生產的凍干粉保證了其品質的穩定性，并能減小其遺傳變異。試驗一般只需要24小時即可完成，操作簡便、花費低。Ames試驗一般需要48-72小時完成，要配制多種培養基，所需材料多、費用高、費時較多。
　　(4)為了使Mutatox方法標準化，已經有大量的工作比較了Mutatox方法與Ames試驗對單一化合物和環境樣品致突變性檢測的靈敏度和準確性。Johnson B.T. 對8種典型致突變前體物的檢測結果證明，Mutatox方法和Ames試驗在定性和定量兩方面的靈敏度相近，Mutatox方法可成為檢測復雜環境中致突變物質的一個有效的監測手段。謝思琴、顧宗濂等對發光細菌暗變種T9171的靈敏度進行了研究，結果充分說明T9171試驗與Ames試驗檢測遺傳毒物所反映的遺傳毒性水平具有較好的一致性。

4．應用
　　近年來，科學工作者已經用發光細菌暗變種檢測出100多種單一化合物的致突變性，同時也用于檢測各種環境樣品的致突變性。Kwan等用Mutatox方法測試了河水和沉積物的有機提取物的致突變性，同時檢測了其急性和慢性毒性，證明Mutatox是成組試驗（battery of tests）中有用的方法。Békaert等利用Ames和Mutatox試驗、活體兩棲動物微核試驗對被PAHs和重金屬污染的土壤浸出液進行致突變性檢測，通過非過濾樣品和過濾樣品的比較試驗，指出Mutatox試驗中樣品不經過0.45μm膜過濾能更準確地檢出顆粒物上吸附的生物活性污染物的致突變性。
　　此外，Johnson用Mutatox和Microtox方法測定了50多種農藥、致突變劑和工業污染物，Mutatox方法對各種化合物的敏感性與文獻報道的Ames實驗結果相一致，統計分析結果表明急性毒性和致突變性之間存在著明顯的相關性（p<0.05），并利用這兩種方法測試了8個有機沉積提取物。
　　1993年以來，我國學者利用明亮發光桿菌的自發暗變種T9171進行了一些研究工作。首先研究了T9171暗變種對5種已知的致突變劑的回復突變效應，利用所建立的實驗方法檢測了工業廢渣的致突變效應，結果與Ames試驗結果的趨勢相似。將暗變種T9171制成凍干粉，采用改進的實驗方法研究了36種有機化合物的致突變效應，并與Ames試驗比較，以一致陽性的受試物最低劑量進行相關分析，在0.01的顯著性水平上兩種方法的吻合率達69%。趙華清等將此方法應用于環境樣品中，檢測了14種環境水樣和9種化合物的基因毒性，結果說明加S9能大大提高發光細菌暗變種的檢測靈敏度。

　　Mutatox方法在國際上已經得到了一定程度的應用，但是由于凍干粉價格相對較高，很難在我國推廣。我國學者自行分離出暗變種T9171，并進行了初步的研究，但該法的測定步驟及其判斷標準還有待于進一步完善。隨著簡便、快速、經濟的發光細菌暗變種測試方法的逐步成熟，并與其它化學和生物測試方法聯合，應用前景將會非常廣闊。