常紅1 胡建英1* 邵兵1,2 楊敏2
1.北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)系，北京，100871；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心

　　近年的研究表明許多化學(xué)物質(zhì)干擾人類(lèi)及野生動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng),導(dǎo)致男性精子數(shù)減少,野生生物生殖機(jī)能和生殖器官發(fā)育出現(xiàn)異常現(xiàn)象。在這類(lèi)物質(zhì)中,人工合成及自然雌激素是一類(lèi)比較重要的化學(xué)物質(zhì)[1]。
　　由于我國(guó)是當(dāng)今世界上避孕藥生產(chǎn)和銷(xiāo)售量最大的國(guó)家之一，而合成雌激素是避孕藥的主要成分；同時(shí)，我國(guó)的城市污水處理率普遍較低，因此從污染水平看，我國(guó)存在來(lái)自人類(lèi)，家畜的自然雌激素和人工合成激素的污染較其他發(fā)達(dá)國(guó)家高的污染特征。由于雌激素類(lèi)物質(zhì)在極低濃度條件下顯示出強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用，而且有可能和水體中殘留的其他類(lèi)雌激素物質(zhì)發(fā)生協(xié)同作用，因此這類(lèi)物質(zhì)對(duì)生態(tài)環(huán)境潛在的危害性是不可忽視的。
　　目前用于監(jiān)測(cè)環(huán)境中痕量雌激素的方法是衍生-GC/MS法[2]。由于衍生-GC/MS法操作繁雜，衍生率變化大等原因，實(shí)際應(yīng)用起來(lái)比較困難.Maria[3]等建立了幾種典型的雌激素的LC/MS分析法，但到目前為止僅僅停留在標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)，應(yīng)用到環(huán)境中痕量雌激素分析還有待進(jìn)一步的完善。
　　本研究選擇了在我國(guó)生產(chǎn)產(chǎn)量比較大的3種合成雌激素，己烷雌酚（DES）、戊酸雌二醇(EV)、炔雌醇(EE)；3種自然雌激素,雌二醇(E2)、雌酮(E1)和雌三醇(E3)和雙酚A(BPA)，建立了用于以環(huán)境調(diào)查的固相萃取(SPE)-LC-MS聯(lián)用方法。

1. 實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1儀器
　　Waters 2690 Separations Module-Miromass ZMD液質(zhì)-聯(lián)用系統(tǒng), SPS 24固相萃取（SPE）裝置（Varian公司）。
　　1.2試劑、標(biāo)準(zhǔn)品及材料
　　本試驗(yàn)的對(duì)象物質(zhì)的結(jié)構(gòu)如圖-1所示。雌二醇、雌三醇、雌酮，雙酚A、己烷雌酚、戊酸雌二醇、炔雌醇，均來(lái)自日本和光公司；純水（電導(dǎo)率，18.1Ω.cm-1）；乙氰、甲醇都為HPLC級(jí)（Fisher公司）；StrataTMC-18-E 固相萃取柱（500mg/6ml）。
　　1.3樣品前處理
　　取500ml水樣，濾紙過(guò)濾后用固相萃取柱進(jìn)行濃縮。柱活化條件：6ml 乙氰，6ml甲醇，6ml超純水。上樣速度：3-5ml/min。洗脫條件：10ml乙氰。洗脫液在微弱氮?dú)庀麓蹈桑靡仪瓒ㄈ葜?.5ml。
　　1.4 LC-MS分析條件
　　本文用Waters Xterra MS C18（2.1×150mm）色譜柱分離分析對(duì)象物質(zhì)。流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相B：乙氰。采用梯度淋洗，梯度條件：在15min內(nèi)流動(dòng)相B從10%線(xiàn)性變化到50%， 然后保持到25min不變，然后在5min內(nèi)流動(dòng)相B從50% 增加至100%,保持5min不變。
　　質(zhì)譜條件：去溶劑氣流量500 l/h，去溶劑溫度400°C，錐孔氣流量100 l/h，離子源的溫度100°C，噴霧毛細(xì)管電壓2.0KV。

2. 結(jié)果與討論

　　2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
　　為了得到最大的靈敏度，首先，對(duì)可能影響質(zhì)譜靈敏度的的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)離子源的錐孔電壓對(duì)靈敏度影響較大。圖-2為7種對(duì)象物質(zhì)在不同錐孔電壓下的響應(yīng)曲線(xiàn)。從圖可知，各對(duì)象物質(zhì)在最大靈敏度響應(yīng)時(shí)的錐孔電壓(V)有很大的不同，獲得最高靈敏度時(shí)的錐孔電壓分別為E1（50 ）、E2（60）、E3（60）、BPA（30）、EV（50）、HEXO（30）、EE（50）。
　　2.2 色譜分離及定量

表-1 7種物質(zhì)的性質(zhì)、回收率和檢測(cè)限 物質(zhì) 分子量 logPow LC-MS
LOD(μg/l) 回收率(%) E1 270 3.69 0.4 87.6 E2 272 4.13 0.2 78.2 E3 288 2.94 6.2 73.1

　　如圖1和表1所示，對(duì)象物質(zhì)具有非常相似的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。為了有效地分離具有相似性質(zhì)的對(duì)象物質(zhì)，本試驗(yàn)采用了流動(dòng)相組分梯度的方法。圖-3為7種化合物的標(biāo)準(zhǔn)混合物的LC-MS色譜圖。除E2和BPA以外,其他物質(zhì)得到了很好的分離。E2和BPA的分離根據(jù)分子量的不同用MS分離后定量。各物質(zhì)的定量采用外標(biāo)法。結(jié)果表明各種物質(zhì)的濃度-響應(yīng)值具有較好的線(xiàn)形關(guān)系（r2>0.999）。
　　2.3 固相萃取的回收率
　　由于這幾種雌激素物質(zhì)的濃度在環(huán)境中非常低，所以必須建立一個(gè)高效的濃縮方法。常用的固相萃取柱填料有C-18、高分子以及石墨化碳黑（GCB）等。考慮到低濃度測(cè)定時(shí)，盡可能減少雜質(zhì)峰的影響，本文選用了吸附性相對(duì)較低的C-18作為濃縮用固相萃取柱,并對(duì)不同添加濃度條件下的回收效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。圖-4表示標(biāo)準(zhǔn)添加濃度為0.18μg/l時(shí)的LC-MS色譜圖。各物質(zhì)的回收率如表-1所示。E1、E2、BPA、DES的回收率都高于80%，EV的回收率偏低，為60%。從表的logPow看，造成EV回收率低的原因可能是由于它的極性較低，而沒(méi)有完全從固相柱上洗脫下來(lái)，還有待于進(jìn)一步改善。
　　2.4 檢測(cè)限
　　這7種對(duì)象物質(zhì)的儀器檢測(cè)限（S/N=3）如表-1所示。E1、E2、BPA具有較低的儀器檢測(cè)下限。考慮到方法的濃縮倍數(shù)和各物質(zhì)的回收率，各物質(zhì)的方法檢測(cè)限如表1所示。結(jié)果表明本方法可以測(cè)定環(huán)境中納克每升濃度的對(duì)象物質(zhì)。

3．結(jié)論

　　本文建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水平的合成和自然雌激素的SPE-LC-MS方法。今后，計(jì)劃利用此法檢測(cè)這類(lèi)物質(zhì)在環(huán)境中的濃度水平，研究它們的環(huán)境化學(xué)行為。

參考文獻(xiàn)：

　　[1] Purdom, C.E.；Hardiman, P.A.；Bye, B.J.；Eno, N. C.；Tyler, C.R.；Sumper, J. P. Chem. Ecol. 1994, 8, 275-285.
　　[2] D. Jahr, Chromatographia. 1998, 47, 49.
　　[3] Maria J. Lopez de Alda；Damia Barcelo. Journal of Chromatography A. 2000, 892, 391-406.

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國(guó)家杰出青年科學(xué)基金(49925103)和國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金(40024101)資助

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